丙酮酸检测试剂盒(二硝基苯肼微板法)

一、产品简介：

丙酮酸(Pyruvic acid，PA)又称2-氧代丙酸，是参与整个生物体基本代谢的中间产物之一，可通过乙酰辅酶A和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化，丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用。丙酮酸是糖无氧代谢的产物，科研工作者常将丙酮酸和乳酸一起研究，并用二者的比值推算循环衰竭的程度。丙酮酸检测可采用乳酸脱氢酶催化法或二硝基苯肼比色法。

雅吉生物丙酮酸检测试剂盒(二硝基苯肼微板法)检测原理是在酸性条件下,丙酮酸与二硝基苯肼反应，生成丙酮酸-二硝基苯腙复合物，后者经氧化呈棕红色，通过酶标仪测定520nm处吸光度，据此通过与标准曲线对比可以计算出PA水平。该试剂盒可用于检测植物、细胞或组织、血清等样品中内源性的丙酮酸含量,尤其适用植物样品丙酮酸含量的检测。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

二、产品组成：

三、自备材料：

1、离心管或小试管

2、蒸馏水

3、酶标仪、96孔板

四、操作步骤(仅供参考)：

1、配制组织匀浆液(1×)∶取10ml组织匀浆液(3×)加入20ml蒸馏水即成。

2、配制PA Assay Buffer (1x)∶取10ml PA Assay Buffer (1.5×)加入5ml蒸馏水即成。

3、准备样品︰

①血清、尿液及其他体液样品:血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-20°C冻存。

②组织样品︰称取1g组织样品置于匀浆器中，再加入1ml组织匀浆液(1x)仔细研磨，振摇提取静置30min ,取上清液4000rpm离心10min ,取上清液,用组织匀浆液(1×)定容至2ml , -20℃冻存，用于PA的检测。

③植物材料︰称取1g植物材料置于匀浆器中，再加入1ml组织匀浆液(1×)仔细研磨，振摇提取,静置30min ,取上清液4000rpm离心10min ,取上清液,用组织匀浆液(1×)定容至2ml , -20℃冻存，用于PA的检测。

④高浓度样品:如果样品中含有较高浓度的PA，可以使用原有的裂解液或PBS等进行稀释，如鸡血清可稀释5～10倍后检测。

4、配制标准品工作液︰如果检测血清、尿液等样品，按取丙酮酸标准(6mg/ml):蒸馏水=1：99的比例配制，使浓度达到60μg/ml，如果检测组织样品按丙酮酸标准(6mg/ml) :组织匀浆液(1×)=1:99的比例配制，使浓度达到60μg/ml。

a、检测血清、尿液等样品时，用96孔板按下表操作:

b、检测组织样品时，用96孔板按下表操作:

5、PA加样︰按照下表设置空白孔、标准孔、测定孔，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的PA浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。

a、检测血清、尿液等样品时，用96孔板按下表操作:

b、检测组织样品时，用96孔板按下表操作︰

6、PA测定∶混匀静置10min，其中空白孔呈无色或淡黄色，标准孔依次呈不同程度的棕红色。以空白孔调零，酶标仪520nm读取标准孔、测定孔的吸光度值(记为A_标准、A_测定)。

计算：

以各丙酮酸标准浓度(1~6号)为横坐标，以对应各丙酮酸标准A_标准为纵坐标，绘制丙酮酸标准曲线，血清、尿液等的丙酮酸含量直接根据标准曲线求得。

组织丙酮酸(μg/g)=A×N/m

血清丙酮酸(μg/ml)=A×N

式中:

A=通过标准曲线计算样品的丙酮酸浓度(μg/ml)

N=稀释倍数

m=样品的质量(g)

注意事项:

1、所加试剂顺序不可颠倒，先加丙酮酸标准液或待测液，再加组织匀浆液(1×)，最后加PA Assay Buffer(1×)。

2、配制的丙酮酸标准(60μg/m)应4°℃避光保存，24h 有效。

3、组织匀浆液有腐蚀性，应小心操作。

4、健康成年人空腹静脉全血丙酮酸含量为3~9μg/ml。

5、如果没有酶标仪，也可以使用分光光度计测定，检测样品量会相应减少。

6、标准曲线的各点应分布均匀，范围适中。

7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期:6个月有效。4C运输，4°℃保存。

附录∶参考标准曲线范围:雅吉生物在室温条件下通过酶标仪520nm测定丙酮酸标准在1~60μg/ml时，其吸光度多在0.10~2.40之间。根据雅吉测定丙酮酸标准在1、2、4、6、12、24、36、48、60μg/ml时的吸光度，

作出标准曲线如下︰

注意:由于检测仪器和操作手法等条件的不同，参考值范围会有波动，该值仅供参考，对于要求精确计算丙酮酸含量的，可以采用多点标准曲线重复测定;根据雅吉生物测定经验显示，标准品浓度在1μg/ml以下，标准品浓度在60μg/ml 以上，标准曲线会有偏差。