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过氧化氢(H2O2)检测试剂盒(硫酸钛比色法)説明书

2024-12-18


过氧化氢H2O2检测试剂盒(硫酸钛比色法)

一、产品简介:

过氧化氢(H2O2)是生物体内最常见的活性氧分子,主要由SOD和XOD等催化产生,由CAT和POD等催化降解,H2O2不仅是重要的活性氧之一,也是活性氧相互转化的枢纽。生命体内积累的H2O2是由一些氧化物催化超氧阴离子发生氧化还原反应而形成,H2O2相对超氧阴离子性质稳定,但其存在可以直接或间接导致细胞膜脂质过氧化损害,加速细胞的衰老和解体,H2O2也是许多氧化应激反应中的关键调节因子。

雅吉生物过氧化氢(H2O2检测试剂盒(硫酸钛比色法)其检测原理是H2O2与硫酸钛反应生成的过氧化物-钛复合物黄色沉淀,溶解于强酸中,其黄色深浅与过氧化氢浓度在一定范围内呈线性关系,可通过比色法检测412nm处吸光度,主要用于检测植物组织、血清、血浆等样品中过氧化氢(H2O2)含量。该试剂盒仅用于科研领域不适用于临床诊断或其他用途。

 

二、产品组成:

名称

50T

Storage

试剂(A):H2O2基液

1ml

4℃

试剂(B):碱性基液

10.5ml

RT

试剂(C):硫酸钛

0.3g

RT

试剂(D):酸性基液

100ml

RT

 

三、自备材料:

1、蒸馏水、丙酮

2、匀浆器或研钵

3、低温离心机

4、分光光度计、比色杯

 

四、操作步骤(仅供参考)

1、准备样品︰

①植物样品∶取正常或逆境下的新鲜植物组织,清洗干净,擦干,切碎,迅速称取5g ,加入5ml预冷的丙酮,在冰浴条件下迅速匀浆或研磨,4℃ 12000g离心20min,收集上清液,测量提取液总体积,4℃保存备用。

②血浆、血清和尿液样品︰血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于该试剂盒的测定,4℃保存,用于过氧化氢的检测。

③高活性样品∶如果样品中含有较高浓度的过氧化氢,可以使用丙酮进行恰当的稀释。

2、配制10mM H2O2标准溶液∶由于过氧化氢不是非常稳定,使用前需自行测定过氧化氢的实际浓度,该试剂盒提供的H2O2基液的H2O2浓度约为1M,用蒸馏水稀释100倍,使H2O2浓度约为10mM,蒸馏水调零,分光光度计测定A240,根据公式H2O2浓度(mM)=22.94×A240计算出H2O2基液中H2O2的实际浓度,再用丙酮稀释H2O2基液配制10mM H2O2丙酮标准溶液(一般情况下新配制的10mM H2O2基液A2400.4~0.45,3个月以后A2400.35~0.42)。

按下表依次稀释(常用浓度0.3-3mM,即1~5号)∶

 

加入物(ml)

1

2

3

4

5

6

7

丙酮-H2O标准(10mM)

0.03

0.05

0.08

0.1

0.3

0.5

0.8

预冷丙酮

0.97

0.95

0.92

0.9

0.7

0.5

0.2

 H2O2浓度(mM

0.3

0.5

0.8

1

3

5

8

3、配制硫酸钛溶液∶0.3g 硫酸钛加入 6ml蒸馏水中,即为5%硫酸钛溶液,4C保存。

4、H2O2加样∶按照下表设置空白管、标准管、测定管,溶液应按照顺序依次加入,并注意避免产生气泡;如果样品中的H2O2浓度过高,可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定,样品的检测最好能设置平行管。

 

加入物(ml)

空白管

标准管

测定管

预冷丙酮

1

系列丙酮-H2O2标准(1~7号)

1

代测样品

1

碱性基液(直接加入到溶液)

0.2

0.2

0.2

硫酸钛溶液(直接加入到溶液)

0.1

0.1

0.1

加入碱性基液、硫酸钛溶液时,应直接加至溶液中,不要粘到管壁

 

5、H2O2测定∶混匀,室温放置5min , 12000g离心15min,弃上清液,留取沉淀,如有必要可加入预冷丙酮反复洗涤沉淀物,向各管的沉淀中加入2ml酸性基液,摇动,使沉淀完全溶解;比色杯光径1cm,空白管调零,分光光度计测定412nm处各标准管、测定管的吸光度,如果没有分光光度计,亦可用酶标仪检测。

 

五、计算:以系列丙酮-H2O2标准(0.3、0.5、0.8、1、3、5、8 mM)为横坐标,以对应的吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,求得回归方程;以测定管吸光度代入回归方程求得待测样品中H2O2的浓度。

组织样品H2O2(mmol/g)=(C0×VT×N)/m

液体样品H2O2 (mmol/L)=C0×N

式中:

Co=根据待测样品的吸光度在标准曲线求得H2O2浓度(mM)

VT=待测样品的总体积(L)

m=样品质量(g)

N=样本稀释倍数

六、注意事项:

1、该试剂盒亦可用酶标仪进行检测,但检测的样本数相应增加。

2、加入碱性基液、硫酸钛溶液时,应直接加入至溶液中,不要粘到管壁。

3、过氧化物-钛复合物黄色沉淀溶解于酸性基液时需要一段时间,需完全溶解,否则有可能影响测定结果。

4、H2O2基液和碱性基液应严格密闭保存,避免挥发,否则效率会下降。

5、H2O2基液和酸性基液有一定腐蚀性,请小心操作。

6、硫酸钛溶解于水后应尽早使用,如暂时不用,可短期放置4℃冰箱保存﹔亦可用分析天平称取一定量的粉剂,配置5%的浓度即可。

7、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

七、 有效期∶12个月有效。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

八、附录∶标准曲线制作: 雅吉生物在室温条件下按说明书操作,对系列标准进行吸光度的测定,其吸光度及标准曲线如下(仅供参考),我们采用H2O2标准(0.1、0.3、0.5、0.8、1、3.5、8 、10mM)绘制标准曲线(标准品浓度过高或过低都有可能影响标准曲线的准确性)∶

 

H2O2标准(mM)

0.1

0.3

0.5

0.8

1

吸光度

0.009

0.065

0.141

0.216

0.264

H2O2标准(mM)

3

5

8

10

 

吸光度

0.812

1.262

2.010

2.355

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

注意:H2O2浓度低于0.3mM基本无色,0.3~1mM为黄色,3~10mM为橙黄色,效果参考如下。