上海雅吉生物公司专业提供细胞技术服务。细胞质粒基因诱导表达，稳定细胞株pool，单克隆稳定细胞株筛选，药筛基因去除，诱导性表达质粒构建，转基因表达鉴定，包括：基因敲入/敲除，常规基因稳转、Luc1/2，诱导性表达，基因敲入/敲除，常规基因稳转、Luc1/2、诱导性表达，基因原位敲入/敲除，Cre转染、单克隆筛选、药筛基因去除鉴定等。更多细胞技术服务项目周期及报价请咨询销售经理
293T细胞D228-Middle基因过表达稳转株因过表达稳转株是指将目的基因整合进宿主细胞的基因组中，使该基因能在细胞内长期且稳定地过量表达，其在基因功能研究、疾病模型的构建、药物筛选、蛋白质生产以及基因 等多个领域有着广泛的应用。
构建方法
载体构建：将目的基因连接到合适的表达载体上，常用的载体有质粒、病毒载体等。表达载体中通常含有强启动子，以驱动目的基因的高效转录。
细胞转染：将构建好的载体导入细胞中，常用的转染方法有脂质体转染、电穿孔法、病毒感染等。对于难以转染的细胞，病毒感染法较为常用，如慢病毒载体可将目的基因整合到细胞基因组中，实现稳定表达。
筛选稳定表达细胞株：转染后，利用载体上携带的筛选标记，如抗生素抗性基因，通过在培养基中添加相应抗生素，筛选出成功转染并稳定表达目的基因的细胞株。
优势
稳定遗传：目的基因能够稳定地存在于细胞基因组中，并随细胞分裂传递给子代细胞，可长期、稳定地表达目的基因，便于长期研究和实验。
可调控性：可根据实验需求，选择不同的诱导型启动子或调控元件，实现对目的基因表达的时空调控。
产品特点
高效表达：通过优化的载体系统和筛选标记，确保目标基因的高效表达。
稳定性高：目标基因稳定整合到宿主基因组中，长期培养不易丢失。
多种宿主选择：提供多种宿主细胞系，如HEK293、CHO、HeLa等，满足不同实验需求。
定制服务：可根据客户需求，定制特定基因的过表达稳转株。
293T细胞D228-Middle基因过表达稳转株传代培养
细胞消化：当细胞生长达到 80% - 90% 汇合度时，需要进行传代培养，以避免细胞过度生长导致营养缺乏和代谢产物积累。对于贴壁细胞，首先吸去培养基，用 PBS 缓冲液清洗细胞 1 - 2 次，然后加入适量的胰蛋白酶 - EDTA 消化液，在 37℃下消化 1 - 5 分钟，期间不断观察细胞状态，当细胞变圆并开始脱离瓶壁时，加入含有血清的培养基终止消化。对于悬浮细胞，可直接通过离心收集细胞，然后用新鲜培养基重悬细胞进行传代。
细胞传代：将消化后的细胞悬液或离心收集的悬浮细胞，按照一定的比例（如 1:2、1:3 等）接种到新的培养瓶或培养皿中，加入适量的培养基，继续培养。
b、细胞复苏：
1、从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速将其置入 37℃水浴中解冻， 直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；
2、将冻存管中的细胞移至含 5ml 完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；
3、弃上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养；
4、隔天，换用新鲜完全培养基继续培养。
c、细胞冻存：
1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心 5min；
3、 弃上清，沉淀细胞加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
4、 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱即可，如后期要将细胞转入液氮罐中，则需在-80℃冰箱 中存放24小时以上再转入液氮罐中。
293T细胞D228-Middle基因过表达稳转株注意事项
细胞状态：冻存的细胞应处于对数生长期，状态良好，活力高，这样可以提高细胞冻存后的存活率。
冻存液配制：DMSO 应选择高质量的产品，且在使用前需进行过滤除菌。冻存液应现用现配，避免长时间放置。
降温与升温速度：冻存时要严格按照梯度降温的步骤进行，避免降温过快导致细胞内冰晶形成，损伤细胞。复苏时则要快速升温，减少细胞在低温下的暴露时间，防止冰晶再次形成。
无菌操作：整个细胞冻存与复苏过程都要在无菌条件下进行，防止微生物污染。使用的器材和试剂都需经过严格的灭菌处理。
记录与标记：做好细胞冻存的记录，包括细胞名称、冻存日期、冻存管编号等信息，并在冻存管上清晰标记，以便后续查找和使用。
复苏后观察：细胞复苏后要密切观察细胞的生长状态，如细胞贴壁情况、形态变化、增殖速度等。如有异常，应及时分析原因并采取相应措施。
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