上海雅吉生物公司专业提供细胞技术服务。细胞质粒基因诱导表达，稳定细胞株pool，单克隆稳定细胞株筛选，药筛基因去除，诱导性表达质粒构建，转基因表达鉴定，包括：基因敲入/敲除，常规基因稳转、Luc1/2，诱导性表达，基因敲入/敲除，常规基因稳转、Luc1/2、诱导性表达，基因原位敲入/敲除，Cre转染、单克隆筛选、药筛基因去除鉴定等。更多细胞技术服务项目周期及报价咨询销售经理
3T3-L1mAkr3KO基因过表达稳转株：基因过表达稳转株是指将目的基因整合进宿主细胞的基因组中，使该基因能在细胞内长期且稳定地过量表达，其在基因功能研究、疾病模型的构建、药物筛选、蛋白质生产以及基因 等多个领域有着广泛的应用。
构建方法
载体构建：将目的基因连接到合适的表达载体上，常用的载体有质粒、病毒载体等。表达载体中通常含有强启动子，以驱动目的基因的高效转录。
细胞转染：将构建好的载体导入细胞中，常用的转染方法有脂质体转染、电穿孔法、病毒感染等。对于难以转染的细胞，病毒感染法较为常用，如慢病毒载体可将目的基因整合到细胞基因组中，实现稳定表达。
筛选稳定表达细胞株：转染后，利用载体上携带的筛选标记，如抗生素抗性基因，通过在培养基中添加相应抗生素，筛选出成功转染并稳定表达目的基因的细胞株。
优势
稳定遗传：目的基因能够稳定地存在于细胞基因组中，并随细胞分裂传递给子代细胞，可长期、稳定地表达目的基因，便于长期研究和实验。
可调控性：可根据实验需求，选择不同的诱导型启动子或调控元件，实现对目的基因表达的时空调控。
3T3-L1mAkr3KO基因过表达稳转株传代培养
细胞消化：当细胞生长达到 80% - 90% 汇合度时，需要进行传代培养，以避免细胞过度生长导致营养缺乏和代谢产物积累。对于贴壁细胞，首先吸去培养基，用 PBS 缓冲液清洗细胞 1 - 2 次，然后加入适量的胰蛋白酶 - EDTA 消化液，在 37℃下消化 1 - 5 分钟，期间不断观察细胞状态，当细胞变圆并开始脱离瓶壁时，加入含有血清的培养基终止消化。对于悬浮细胞，可直接通过离心收集细胞，然后用新鲜培养基重悬细胞进行传代。
细胞传代：将消化后的细胞悬液或离心收集的悬浮细胞，按照一定的比例（如 1:2、1:3 等）接种到新的培养瓶或培养皿中，加入适量的培养基，继续培养。
b、细胞复苏：
1、从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速将其置入 37℃水浴中解冻， 直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；
2、将冻存管中的细胞移至含 5ml 完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；
3、弃上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养；
4、隔天，换用新鲜完全培养基继续培养。
c、细胞冻存：
1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心 5min；
3、 弃上清，沉淀细胞加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
4、 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱即可，如后期要将细胞转入液氮罐中，则需在-80℃冰箱 中存放24小时以上再转入液氮罐中。
3T3-L1mAkr3KO基因过表达稳转株注意事项
细胞状态：冻存的细胞应处于对数生长期，状态良好，活力高，这样可以提高细胞冻存后的存活率。
冻存液配制：DMSO 应选择高质量的产品，且在使用前需进行过滤除菌。冻存液应现用现配，避免长时间放置。
降温与升温速度：冻存时要严格按照梯度降温的步骤进行，避免降温过快导致细胞内冰晶形成，损伤细胞。复苏时则要快速升温，减少细胞在低温下的暴露时间，防止冰晶再次形成。
无菌操作：整个细胞冻存与复苏过程都要在无菌条件下进行，防止微生物污染。使用的器材和试剂都需经过严格的灭菌处理。
记录与标记：做好细胞冻存的记录，包括细胞名称、冻存日期、冻存管编号等信息，并在冻存管上清晰标记，以便后续查找和使用。
复苏后观察：细胞复苏后要密切观察细胞的生长状态，如细胞贴壁情况、形态变化、增殖速度等。如有异常，应及时分析原因并采取相应措施。
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