实验前准备

1. 试剂盒检查：核对试剂盒的名称、批号、有效期等信息，确保试剂盒完整无损且在有效期内。检查试剂盒内各组分是否齐全，有无漏液、变质等情况。
2. 样本准备：根据实验要求采集合适的样本，如血清、血浆、细胞培养上清等。样本采集后应尽快进行检测，如需保存，应按照试剂盒说明书的要求进行保存，一般血清和血浆样本可在 -20℃或 -80℃下保存，避免反复冻融。
3. 试剂准备：将试剂盒从冰箱中取出，平衡至室温（一般为 20 - 25℃）。按照说明书的要求配制所需的试剂，如包被缓冲液、封闭液、洗涤液、底物溶液等。配制过程中要注意使用精确的量具和正确的稀释方法，确保试剂浓度准确。
4. 仪器设备准备：准备好微量加样器、酶标仪、恒温培养箱、洗板机等仪器设备，并确保其处于正常工作状态。微量加样器要经过校准，保证加样量准确；酶标仪要预热，并进行波长校准和空白调零；洗板机要检查喷头是否通畅，洗涤程序是否设置正确。

操作步骤

1. 包被
   • 用包被缓冲液将特异性抗体或抗原稀释至适当浓度，一般为 1 - 10μg/mL。
   • 向酶标板的每个孔中加入 100μL 稀释后的抗体或抗原溶液，将酶标板密封，置于 4℃冰箱中过夜孵育或 37℃恒温培养箱中孵育 1 - 2 小时，使抗体或抗原牢固地吸附在微孔板表面。
2. 洗涤
   • 孵育结束后，倒掉孔内液体，将酶标板倒扣在吸水纸上，拍干残留液体。
   • 每孔加入 200 - 300μL 洗涤液，静置 1 - 2 分钟，然后倒掉洗涤液，重复洗涤 3 - 5 次，以去除未结合的物质。洗涤过程中要注意避免交叉污染。
3. 封闭
   • 向每孔中加入 200μL 封闭液，将酶标板密封，置于 37℃恒温培养箱中孵育 1 - 2 小时，以封闭微孔板上未被抗体或抗原占据的位点，减少非特异性结合。
4. 洗涤：同步骤 2，再次洗涤酶标板 3 - 5 次，彻底去除封闭液。
5. 加样
   • 将样本和标准品用样品稀释液稀释至适当浓度。一般先将标准品进行倍比稀释，制成一系列不同浓度的标准品溶液，如 0、1、2、4、8、16ng/mL 等。
   • 向酶标板的相应孔中加入 100μL 稀释后的样本或标准品溶液，设复孔，一般每个样本或标准品设 2 - 3 个复孔。将酶标板密封，置于 37℃恒温培养箱中孵育 1 - 2 小时，使样本中的抗原或抗体与包被在微孔板上的抗体或抗原发生特异性结合。
6. 洗涤：同步骤 2，洗涤酶标板 3 - 5 次，去除未结合的样本和标准品。
7. 加酶标抗体
   • 用酶标抗体稀释液将酶标抗体稀释至适当浓度。
   • 向每孔中加入 100μL 稀释后的酶标抗体溶液，将酶标板密封，置于 37℃恒温培养箱中孵育 1 - 2 小时，使酶标抗体与结合在微孔板上的抗原 - 抗体复合物发生特异性结合。
8. 洗涤：同步骤 2，洗涤酶标板 5 - 6 次，彻底去除未结合的酶标抗体。
9. 加底物显色
   • 向每孔中加入 100μL 底物溶液，轻轻混匀，避免产生气泡。将酶标板置于 37℃恒温培养箱中避光孵育 15 - 30 分钟，使底物在酶的催化作用下发生显色反应。
10. 终止反应
    • 当显色达到适当程度时，向每孔中加入 50μL 终止液，终止显色反应。此时溶液颜色应从蓝色变为黄色。
11. 结果测定
    • 立即用酶标仪在规定的波长下测定各孔的吸光度值（OD 值）。一般常用的波长为 450nm 或 492nm，具体波长根据试剂盒说明书和底物的特性而定。

实验后处理

1. 数据记录与分析：记录酶标仪测定的各孔 OD 值，根据标准品的浓度和对应的 OD 值绘制标准曲线，然后通过标准曲线计算出样本中目标物质的浓度。
2. 结果报告：按照实验要求和相关标准，撰写实验报告，包括实验目的、方法、结果、结论等内容。报告中要注明样本类型、检测项目、检测结果、试剂盒名称和批号等信息。
3. 清理实验器材：将用过的酶标板、吸头、试剂瓶等实验器材进行分类处理。酶标板和吸头一般作为医疗垃圾废弃，试剂瓶等可清洗后妥善保存。对实验台面进行清洁消毒，保持实验室环境整洁。
4. 试剂盒保存：将剩余的试剂盒组分按照说明书的要求进行保存，一般需要在 2 - 8℃或 -20℃下保存，避免试剂盒受到污染和变质，以备下次使用。