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选择抗体的8个步骤
2024-11-06
1.确定目的蛋白名称
首先需要明确需要检测的蛋白是什么，以选择对应的抗体。在这个过程中需要注意蛋白的中英文名字、别名等信息，可以通过GeneNames 找出目的蛋白的官方命名，再使用GeneCards识别别名以扩大可能的搜索查询范围，因为抗体供应商可能会使用不同的别名来命名相同的蛋白质。
2.确定目的蛋白其他信息
确定目的蛋白的同分异构体、功能域、加工形式、具有不同亚细胞定位（如细胞外与细胞内等）的结构域以及翻译后修饰的预期特异性。
3.查找目的蛋白序列
使用 Uniprot找出目的蛋白质（及其亚型）的氨基酸序列。
4. 确定与其他物种或蛋白质的潜在交叉反应性
使用NCBI的BLAST工具分析序列，确定目的蛋白中是否存在具有单个抗原特有的线性表位不同区域，以及靶抗原中的抗体是否可能与那些拥有相似序列的其他蛋白质发生交叉反应。
5. 表位选择
根据研究目的，确定合适的表位。该表位可以是靶抗原中具有特异性的独特区域，使得抗体能够精确识别并与之结合；也可以是那些具有交叉反应的区域，让抗体能够与其他相似序列的蛋白质产生相互作用。
6.确定实验类型
抗体适用的实验类型往往跟抗原表位的类型有关。线性表位适合用在蛋白质印迹（Western Blot）和石蜡包埋的免疫组化实验中，天然表位更适用于免疫沉淀（IP）、冷冻切片免疫组织学、流式细胞术和酶联免疫（ELISA）这些实验。此外，那些能识别出福尔马林耐药表位并用于免疫组化检测的抗体，同样有可能在使用福尔马林固定的其他技术（如免疫沉淀（ChIP））中展现出良好的效用。
7. 确定一抗同种型和宿主
在单次实验中，如果需要同时使用多种一抗进行探测，选择具有不同宿主或同种型的一抗会更为有利。这样我们就可以利用带有不同荧光标记的同种型或宿主特异性二抗来同时检测多个目标。此方法在共定位或蛋白质相互作用研究中尤为常见。
8. 抗体克隆性的选择
抗体的克隆性的选择，关键在于其预期的用途。多克隆抗体能够识别抗原上的多个表位，检测信号较强，但特异性相对较低，因此多克隆抗体采用Western Blot等技术，通过区分不同分子量处的非目标结合带，来进行抗原的检测。相比之下，单克隆抗体则具有更高的特异性，因为它们只针对单一的表位和同种型，这使得它们在天然组织的研究中表现出色，如免疫沉淀IP和流式细胞术等应用。
