黄曲霉毒素B1检测试剂盒

使用说明书

（酶联免疫法）

 1 原理及用途

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测谷物、饲料等样本中的黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样本溶液，样本中的黄曲霉毒素B1和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗黄曲霉毒素B1抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含黄曲霉毒素B1含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中黄曲霉毒素B1的残留量。

2 技术指标

2.1 试剂盒灵敏度：0.03ppb(ng/ml)

2.2 反应模式：25℃，30min～15min

2.3 检测下限：

谷物…………………………………………0.15ppb

玉米皮、麸皮等吸水性强样本……………0.6ppb

食用油、花生油……………………………0.6ppb

酱类、饼干、糕点等食品或调料…………0.6ppb

啤酒…………………………………………0.3ppb

葡萄酒、酱油、醋…………………………0.15ppb

茶叶…………………………………………0.2ppb

麦类…………………………………………1.2ppb

2.4 交叉反应率：

黄曲霉毒素B1…………………………100%

2.5 样本回收率：

谷物…………………………………85±15%

花生油………………………………82±15%

食用油………………………………85±15%

酱类、饼干、糕点等食品或调料…83±15%

啤酒…………………………………84±15%

葡萄酒、酱油、醋…………………87±15%

茶叶、麦类…………………………75±15%

3 试剂盒组成

酶标板……………………………96孔

标准液（黑盖）：各1ml

0ppb、0.03ppb、0.06ppb、0.12ppb、0.24ppb、0.48ppb

高标准液：100ppb …………………1ml

酶标记物（红盖） …………………5.5ml

抗体工作液（蓝盖） ………………5.5ml

底物液A（白盖）……………………6ml

底物液B（黑盖）……………………6ml

终止液（黄盖）………………………6ml

20×浓缩洗涤液（白盖）……………40ml

说明书 ………………………………1份

盖板膜…………………………………1张

自封袋…………………………………1个

4 需要的器材和试剂

4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：单道20μl-200μl，100μl-1000μl、多道300μl

4.3 试剂：甲醇、正己烷、三氯甲烷

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知：

实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液：

配液1：样本提取液

70%甲醇，即V甲醇:V去离子水=7：3。

配液2：工作洗涤液

将20×浓缩洗涤液20倍稀释(1份20×浓缩洗涤液加19份去离子水)。

配液3：样本复溶液

35%甲醇，即V甲醇:V去离子水=3.5：6.5。

5.3 样本前处理步骤：

5.3.1 谷物处理方法 

1）称取2g±0.05g粉碎样本于50ml离心管中，加5ml样本提取液（配液1），振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取0.5ml上清，加入0.5ml去离子水，混匀；

3）取50μl进行分析。

    样本稀释倍数：5    检测下限：0.15ppb

5.3.2 玉米皮、麦麸等吸水性强样本处理方法 

1）称取2g±0.05g粉碎样本于50ml离心管中，加20ml样本提取液（配液1），振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取0.5ml上清，加入0.5ml去离子水，混匀；（对于毒素含量极高的样本可用样本复溶液（配液3）稀释后再测。比如取2）中的混合液0.1ml加0.9ml样本复溶液（配液3）混匀，最终样本稀释倍数为200，检测下限为6ppb。）

3）取50μl进行分析。

样本稀释倍数：20    检测下限：0.6ppb

注：由于毒素在样本中的分布呈非均匀状态，取样时需多点取样充分混匀后再取2g进行试验。

5.3.3 食用油、花生油处理方法

1）称取2ml样本于50ml离心管中，加8ml正己烷和10ml样本提取液（配液1），振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）去除上层液体，取0.5ml下层液体加入0.5ml去离子水，混匀，再取混匀液体0.5ml加入0.5ml样本复溶液（配液3），振荡30s；

3）取50μl进行分析。

    样本稀释倍数：20    检测下限：0.6ppb

5.3.4 酱类、饼干、糕点等食品或调料处理方法

1）称取1g±0.05g粉碎样本至15ml离心管中，加10ml甲醇，振荡5分钟，室温4000转/分离心5分钟；

2）取2ml上清至15ml离心管中，于50℃-60℃下氮气或空气吹干；

3）加入2ml去离子水，振荡30s，再加入6ml三氯甲烷，振荡5分钟，室温4000转/分离心5分钟；

4）取下层三氯甲烷液1.5ml至10ml离心管，于50℃-60℃下氮气或空气吹干；

5）加入0.5ml正己烷，振荡30s，再加入1ml样本复溶液（配液3），振荡1分钟，室温4000转/分离心5分钟；

6）去除上层有机物相，取下层清液50μl分析。。

样本稀释倍数：20倍       检测下限：0.6ppb

5.3.5 啤酒处理方法

1）将啤酒充分搅拌（去除二氧化碳），取2ml啤酒样本，加入1ml蒸馏水，再加入7ml甲醇，振荡5分钟；

2）取混匀后的样本液0.5ml加入0.5ml去离子水，混匀；

3）取50μl进行分析。

    样本稀释倍数：10    检测下限：0.3ppb

5.3.6 葡萄酒、酱油、醋处理方法

1）取2ml样本，加入2ml蒸馏水，再加入10ml三氯甲烷，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取下层液体1ml于50-60℃下氮气或空气下吹干；

3）加入0.5ml样本提取液（配液1）充分溶解干燥物，再加入0.5ml去离子水，混匀；

4）取50μl进行分析。

样本稀释倍数：5    检测下限：0.15ppb

5.3.7 茶叶处理方法

1）称取2g±0.05g粉碎样本于50ml离心管中，加4ml甲醇溶液，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取0.3ml上清，加入0.6ml去离子水，混匀；

3）取50μl进行分析。

样本稀释倍数：6    检测下限：0.2ppb

5.3.8 麦类处理方法 

1）称取1g±0.05g粉碎样本于50ml离心管中，加入2ml样本提取液（配液1），振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取0.2ml上清，加入0.2ml去离子水，振荡30秒，室温4000转/分离心5分钟；

3）取离心后的样本液0.1ml加入0.9ml样本复溶液（配液3），混匀。

4）取50μl进行分析。

样本稀释倍数：40    检测下限：1.2ppb

6 酶联免疫试验步骤

    将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 编    号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

6.2 加样反应：加标准品或样本50μl/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50μl/孔，再加入50μl/孔的抗体工作液，用盖板膜封板，轻轻振荡5秒混匀，25℃反应30分钟。

6.3 洗    涤：小心揭开盖板膜，甩去孔内液体，每孔加350μl工作洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，最后一次拍干（用吸水纸拍干，拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6.4 显    色：每孔加入底物液A 50μl，再加底物液B 50μl，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟（若蓝色过浅，可适当延长反应时间）。

6.5 终    止：每孔加入终止液50μl，轻轻振荡混匀，终止反应。

6.6 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。

7 结果分析

7.1 百分吸光率的计算

    标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值

7.2 标准曲线的绘制与计算

    以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。

    若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

8 注意事项

8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

8.3 混合要均匀，洗板要彻底，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。

8.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。

9 贮藏及保存期

储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，避免冷冻。

保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。