DPPH自由基清除率检测试剂盒(比色法)

一、产品简介：

在生命活动的代谢过程中不断产生各种自由基而自由基的积累会使机体产生氧化损伤而引起衰老、肿瘤、中风、心肌炎和糖尿病等慢性疾病，在众多自由基中2，2-二苯基-1-苦基苯肼( DPPH)是一种较稳定的自由基，当有自由基清除剂存在时颜色由紫色向黄色转变，吸光度随之变小。

雅吉生物 DPPH自由基清除率检测试剂盒(比色法)又称氮自由基清除能力检测试剂盒或氮自由基清除率检测试剂盒，其检测原理是DPPH自由基是一种较稳定的含氮自由基，含一个单电子，溶于乙醇后溶液呈紫色，在517nm下有强吸收，如果有其他物质提供一个电子与此单电子配对，溶液会褪色，褪色程度与接受电子的量呈正比，通过吸光度下降的程度来反应样品的氮自由基清除能力，主要用于检测血清、植物组织、抗氧化类食品、保健品及药品等样本。该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

二、产品组成：

三、自备材料：

1、蒸馏水、无水乙醇

2、实验材料∶植物组织(芹菜、绿豆、玉米等叶片)、血液、组织样本等

3、研钵或匀浆器或粉碎机或超声破碎机

4、离心机、离心管

5、恒温水浴锅、恒温干燥箱

6、电子天平、30~50目筛

7、分光光度计、比色皿

四、操作步骤(仅供参考)：

1、准备样品∶

①植物样品∶取新鲜植物样本，清洗干净，研钵研碎(粉碎)，干燥箱烘干后过筛，称取0.05g 样品，加入0.8ml氮自由基提取液，40℃水浴浸提30~60min，10000rpm离心10min，上清液待用，4℃保存备用(亦可参考相关资料提取方法提取)。

②血浆、血清和尿液样品︰血浆(用肝素或枸橼酸钠抗凝，不宜使用EDTA 抗凝)4°℃5000rpm离心10min，取上清液待用;血清或尿液样品可直接测定。

③细胞样品︰按每5×10°个细胞加入0.8ml氮自由基提取液，超声破碎(功率200W,超声3s，间隔10s，重复30次)，10000rpm 离心10min，取上清液待用。

④果汁、葡萄酒等样品︰按样品∶氮自由基提取液=1∶9的比例震荡混匀，10000rpm离心10min，上清液待用，4℃保存备用。

⑤高活性样品︰如果样品中有效浓度较高，可用提取液进行恰当的稀释。

2、配制维生素C溶液︰将一支10mg维生素C充分溶解于1ml氮自由基提取液中，即成10mg/ml维生素C溶液;可分成0.1ml的小份，-20℃保存。

3、配制Vc标准工作液︰如需测线性关系，建议用氮自由基提取液将10mg/ml维生素C溶液稀释至20、15、10、8、6、4、2μg/ml的Vc标准工作液;如需清除率约为100%的阳性对照，建议选用大于 30μg/ml 的Vc标准工作液。

4、分光光度计开机预热 30min，调节波长517nm(500~530nm亦可)，无水乙醇调零。

5、DPPH加样∶按照下表设置空白管、样本测定管、样本对照管、阳性对照管，溶液应按照顺序依次加入，混匀，室温避光静置30min。

6、OD值测定∶将各管溶液依次加入到比色皿中，用分光光度计检测各管吸光度值，依次记为A₀、A₁、A₂、A₃。

五、计算：

阳性对照·DPPH清除率(%)= (A₀- A₃)/A₀×100%

待测样本·DPPH清除率(%)=[A₀-( A₁- A₂)]/A₀×100%

备注:

A₀=空白管的吸光度值

A₁=样本测定管的吸光度值

A₂=样本对照管的吸光度值

A₃=阳性对照管的吸光度值

六、注意事项：

1、正式测定之前建议选择2~3个预期差异较大的样本做预实验。

2、实验材料应尽量新鲜，当天提取当天测定。

3、不同样本清除DPPH自由基的能力差异很大。

4、如样本DPPH清除率大于90%，应用提取液稀释；如样本 DPPH清除率小于5%，应提高样本用量以提高有效成分浓度。

5、样品中不宜添加Triton、DTT等可能影响氧化还原反应的成分。

6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

七、有效期：6 个月有效。4℃运输，4℃保存。

附录∶

标准曲线制作∶

在室温条件下按说明书操作，对系列VC标准工作液(20、15、10、8、6、4、2、1μg/ml ）进行吸光度的测定，其数值及标准曲线如下(仅供参考)︰

由上图可知：VC标准工作液在2~8ug/ml时线性关系良好， ·DPPH清除率与Vc浓度呈正相关，当Vc浓度大于10即开始有偏差，Vc浓度大于12时， ·DPPH清除率大于90%。